国家重点基础研究发展计划（编号：2005CB724303）、国家自然科学基金（批准号：10376024）和天津市科委（批准号：033801911）资助项目禽流感是种严重威胁禽类和人类健康的传染病，高致病性禽流感H5N1亚型病毒更引起了全世界范围的高度警惯。据世界动物卫生组织（WorldOrganizationforAnimalHealth，OIE）报告，2004 WHO）统计，自1997年香港首次出现人感染H5N1病随着禽流感病毒基因序列的不断增多，对H5N1病毒的基因研究也在不断深入。到目前为止，GenBank数据库中已有900多个H5N1病毒的基因数组为单股负链RNA，由8个独立的RNA节段组成。每个节段都携带了不同功能的基因，分别负责编码表面蛋白、复制和组装染色体等功能。其中血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）基因编码病毒的囊膜蛋白，负责病毒的吸附和释放。
血凝素在病毒的入侵过程中起重要作用，是许多学者高度关注的研究对象。本研究应用了一种可将基因序列可视化的方法元胞自动机（cellularauto mata，CA），以直观地寻找HA基因序列的一些关键特征，这个方法曾成功应用于对SARS病毒的序列分析和蛋白质亚细胞定位等方面的研究。从H5N1HA核苷酸序列的元胞自动机图中发现了一些其他亚型都没有的指纹特征，这些指纹所对应的是一个长约30bp，主要由A和G组成的片段，称为特征基因片段（featuregenesegment，FGS）。其中*普遍的一种特征基因片段是酸序列称为特征氨基酸片段（featureaminoacidsegment，FAAS），正好对应切割位点插入的氨基酸，这些氨基酸插入对H5N1病毒的高致病性具有非常重要的作用。
为了研究氨基酸插入对切割位点结构和性质的影响，我们通过同源模拟的方法获得了H5N1血凝素蛋白的三维结构，并比较了H5N1HA和1918H1切割位点的结构差异，讨论了H5N1血凝子素切割位点的多种突变情况。为进一步了解这些氨基酸的突变对H5N1病毒高致病性产生的影响，我们分析了切割位点的分子表面和电荷分布，并详细统计了特征氨基酸片段在时间上和地域上的变化状元胞自动机第82号规则的图解1方法元胞自动机。本研究运用元胞自动机的方法来搜索基因特征。元胞自动机可以运用简单的规则，将物理、数学、生物、计算机的复杂体系转为简单、离散、直接、可视化的数学模型。元胞自动机由行行状态为0或1的元胞组成，在每步运算中，元胞的状态由上一步中该元胞的状态以及左右邻居元胞的状态通过简单的规则运算得到。依照这样的规则不断自动演化（因此称为自动机），计算机就建立了一幅表示系统复杂度模式的二进位图。
在本研究中，初始行为编码的核苷酸序列，核苷酸A，C，GT分别编码为00，01，10和11.元胞自动机总共有256条规则，本文采用了第82号规则，如所示。图中白色和黑色的方块分别表示状态*0*和*1*，其中上面一行表示一个元胞和它左右邻居元胞组成的8个可能的状态集合，下面一行则表示根据上面一行状态值演化得到的新的状态值。其中*111*，*110*，‘101’、*100*，*011*，*010*，*001*，*000*分别演化01010010转化为十进制数，数值是82，因此称该规则为第82号规则。每次运算，两个边界元胞的状态都置*0*以进行下一步的运算。例如，序列010110110经过第82号规则的一步运算后变成了同源模拟。已知一个基因片段的序列信息，我们就可以用同源模拟的方法构建其3D结构。
本研究采用了已知晶体结构信息的H5N1血凝素（不包含切割位点结构信息）作为同源模拟的模版。序列的高度相似保证了本次同源模拟的准确性。同源模拟按照以下4个步骤进行：（1）目标链被打断成为短的片段；⑵根据序列比对和模版链的形状在数据库（由5200多个高分辨率的X-射线蛋白晶体结构组成）里搜索匹配的片段；（3）在避免出现任何范德华重叠的前提下，匹配的片段不断插入到目标链结构的相应位置，直到覆盖目标链的所有原子；（4）重复10次后产生一个平均模型，再经过能量*小化就得到了*终的3D结构。
2结果与分析H5N1特征基因片段的识别基于元胞自动机用简单规则处理复杂系统的强大功能，该方法被用来可视化分析现有的HA核苷酸全序列，其中包括397条H5N1HA序列和2098条其他亚型的HA序列。对比了结果中两幅典型的元胞自动机图，上面1幅是H5N1的元胞自动机图，下面一幅是其他亚型（H3N2）的元胞自动机图。我们发现一块深色斜纹是H5N1HA的一个普遍特征，而其他的非H5N1亚型都不具有这样的图案。
这块深色斜纹称为H5N1HA基因的指纹，其对应的核苷酸序列片段位于1012bp左右，长约30bp，主要由A和G组成，称为特征基因片段（featuregenesegment，FGS）。
中有65.4%的序列具备完全相同的特征基因片段，即5'-CAAAGAGAGA-GAAGAAGAAAAAAGAGAGGA-3'，而其他序歹ij的特征基因片段分别具有1~5bp的突变，其中1~5bp的突变比例分别为23.6%，2.4%，6.3%，H5N1病毒的高致病性特征基因片段翻译成多肽后就得到了个特征氨基酸片段（featureaminoacidsegment，FAAS）。这个片段其实是血凝素的前体H0切割位点附近插入的氨基酸序列。血凝素前体H0的长度大约为556个残基，H0裂解成两个子单元HA1和HA2是病毒感染的必要条件。大多数的血凝素前体只能被精氨酸特异的蛋白酶，如胰蛋白酶类所切割，这类蛋白酶已经成功地从老鼠的支气管上皮Clara细胞中分离得到。而在高致病病毒序列中，切割位点附近的碱性氨基酸通过插入或替换的方式不断增加。碱性氨基酸（精氨酸和赖氨酸）的增加使得呼吸系统和消化系统以外的蛋白酶也能够剪切和激活前体蛋白，从而导致大规模组织的病毒感染。很多蛋白酶，如体内大多数组织都普遍存在的弗林蛋白酶等都可以剪切这种序列。病毒感染力的加剧导致了全身范围的病毒感染和多器官衰竭，出现了高致病禽流感病毒感染的病理特征……结构中间红色的区域代表脂肪族氨基酸谷氨酸的存在。众所周知，碱性氨基酸及其携带的正电荷是血凝素能被多种蛋白酶剪切的关键因素。因此从某种角度上，我们可以将分子表面正电荷的完整性与病毒的高致病性联系起来。根据前面的分析，大约35%H5N1的特征基因片段发生了置换或缺失，因此相应的特征氨基酸片段也可能发生了改变。（b）-2~4表示3种存在的特征氨基酸片段QGERRRKKRG，QREIRRKKRG和QRERRR-KRG的分子表面，分别带有1个氨基酸的置换或缺失。第1种情况，QGERRRKKRG是第1个碱性氨基酸被脂肪族氨基酸所替代，覆盖蓝色正电荷的第1号隆起消失，其对应位置的电荷也变成了红色的负电荷和白色的中性电荷。第2种情况，QREIRRKKRG是特征氨基酸片段中间的一个碱性氨基酸被脂肪族氨基酸所替代，第2号隆起的分子表面形态和电荷分布均发生了显著的改变。*后一种情况，第5个碱性氨基酸的缺失，导致相应的隆起也消失了。每种碱性氨基酸突变的情况都会影响分子的表面结构，减少正电荷的分布，*终可能会对病毒的高致病性产生影响。
2.3H5N1特征氨基酸片段的进化规律如果特征氨基酸片段的突变会对病毒的高致病性产生影响，我们就有必要对特征氨基酸片段的突变随时间进化和地域分布的情况进行进一步地统计分析。统计的数据集为1997年后的651个毒株的血凝素蛋白序列（见网络版附表1）。采用序列比对的方法来定位切割位点片段。统计结果如所示，其中Seq.1表示具备完整的碱性氨基酸和正电荷分布的一类片段，与（b）-1相对应；Seq.2表示第1个碱性氨基酸被脂肪族氨基酸所取代的一类片段，与（b）-2相对应；Seq.3表示第4个氨基酸被脂肪族氨基酸所取代的一类片段，与（b）-3相对应；Seq.4表示一个碱性氨基酸缺失的情况，与（b）-4相对应。
根据系统分析，近几年发现的H5N1毒株都与毒株Duck*china*E319-2*03有关，而该毒株具备经典的特征氨基酸片段。我们发现在1997-2004年期间，一直是经典的特征氨基酸片段（即Seq.1）占主导地位，而到了2005年，经典的特征氨基酸片段的比例明显减少，突变的特征氨基酸片段，特别是Seq.2和Seq.4明显增多。2006年这种情况也一直持续，统计的19个序列里有18个都具备突变的特征氨基酸片段Seq.2.H5N1病毒在4个病毒疫情*严重的国家和地区的分布情况如（b）所示，其中泰国、越南和香港几乎没有突变的特征氨基酸片段，但是在中国大陆，病毒却经历了严重的突变。
3讨论我们开发了一种有效搜索血凝素特征基因片段的方法，可以在基因指纹中直观地辨认出来。发现的特征基因片段只存在于H5N1病毒中，而都不存在于其他的禽流感病毒中。特征基因片段长度为30bp，主要有A和G组成。当特征基因片段翻译成蛋白质序列，就得到了一个由多个带正电荷的碱性氨基酸组成的多肽特征氨基酸片段，正好位于血凝素被多种蛋白酶识别和切割的切割位点。H5N1高致病的根本原因与血凝素的切割位点能被多种蛋白酶所识别和切割有关。
运用同源模拟的方法重建了H5N1血凝素蛋白的3D结构，发现其切割环暴露于蛋白酶中，更易于其水解。为了研究特征氨基酸片段的某些氨基酸置换或缺失对电荷分布产生的影响，我们重建了切割位点的分子表面，发现每种碱性氨基酸突变的情况都会影响分子的表面形态，减少正电荷的分布，并可能会对病毒的高致病性产生影响。如果某些位点进*步发生突变，病毒很有可能会丧失其高致病性。进氨基酸片段的比例大大增加，而在前几年，一直是经典的特征氨基酸片段占主导地位；在地域上，中国大陆病毒的特征氨基酸片段大部分都发生了突变，这与中国大陆，特别是南方的复杂环境有关，能加快病毒的突变进程。
本研究详细地分析了H5N1切割位点的结构与性质，有助于进一步挖掘和理解H5N1高致病性的根本原因及基因特征，为将来开发新的H5N1病毒免疫和治疗方法打下了坚实的基础。
