生物工程学报＊本室客座研究员，澳大利亚强生药理研究所基因治疗室主任。
＊＊通讯作者。
特异切割12脂加氧酶mRNA的核酶体外活性及动力学研究刘灿辉孙仑泉田波（中国科学院微生物研究所北京100080）核酶基因。以合成的25个核苷酸长的12脂加氧酶RNA片段为底物与转录的核酶RNA一起保温检测其体外切割活性。实验结果表明，在37℃保温时，核酶在体外对12脂加氧酶具有较高的特异切割活性，其K m值为1300 nmol/ L，其kcat值为0.083/ min ，在50℃保温时，核酶具有很高的切割活性，其kcat值为0.31/核酶是小分子RNA ，能特异性地催化切割RNA分子，因此具有阻断基因表达的巨大潜力。近年来，利用核酶的这种功能来设计能切割一些病原性RNAs的核酶。曾报道有在细胞内切割爱滋病毒RNA的核酶。我们曾得到对PSTVd有高度抗性的核酶转基因马铃薯系。心血管疾病是引起人类死亡的首要原因。血小板型12脂加氧酶（12 LO）能将氧分子插入到花生四烯酸的碳12上，形成12羟基花生四烯酸过氧化物，激活12LO对引起高血压和增加血管紧张素Ⅱ有重要作用。把特异切割12LO的核酶基因转入活细胞中，有可能达到防治心血管病的效果。
1材料和方法1.1特异切割12LO mRNA的核酶的设计提出锤头状核酶催化切割RNA的模式由三部分组成，即包含与切点相邻的保守序列GUC的底物RNA、高度保守的序列构成的核酶二级结构催化区、与底物RNA配对的识别区。首先确定与切点相邻的保守序列GUC位点，即切割位点区域，我们选择12LO包含第92核苷酸处的GUC在内的一段序列为靶RNA ，根据靶RNA的序列，确定核酶的识别区序列，并加入高度保守的具有切割活性的一段序列，即构成具有切割活性的核酶，长度为46个核苷酸，其5′端和3′端的配对长度均为12个核苷酸。
1.2核酶基因的合成及克隆根据所设计的核酶序列，确定核酶单链脱氧寡核苷酸的序列，利用Beckman DNA合成仪合成了该基因的两条寡核苷酸链。通过T4多核苷酸激酶的作用，核酶基因两条寡核苷酸链的5′端磷酸化，成粘端，并用碱性磷酸酶去磷酸化。核酶基因DNA 0.6 mmol/L ATP ，受体菌为DH5α，感受态细胞的制备采用CaCl处理的方法，把连接产物加入到感受态细胞中，置于冰浴中30 min ， 42℃热击90 s后，向其中加入LB培养基，37℃保温60min ，转化细胞的LB平板上，37℃培养过夜。挑选白色克隆，提质粒，通过酶切鉴定筛选阳性克隆。由373A18DNA自动测序仪测定DNA序列。
长度为25个核苷酸的12LO底物RNA ，序列RNasin ，10单位T4多核苷酸激酶，加水至总体积20μL ， 37℃保温30 min ，酚氯仿抽提，乙醇沉淀。
1.4体外转录大量分离纯化质粒。取适量的质粒（10μg）以HindⅢ酶切成线性。大量体外转录反应体积为模板DNA ，以等体积的酚氯仿抽提2次，乙醇沉淀。
1.5核酶的体外活性测定少量核酶与过量12LO底物RNA混合，缓冲2，于37℃或50℃保温适当的时间，保温完毕，加入等体积的终止缓冲液（98 甲酰胺， 10mmol/ L 30s后，聚丙烯酰胺凝胶（8 mol/ L尿素，20 ）电泳，以放射自显影检测。
2结果与讨论2.1特异性切割12LO的核酶基因的设计和合成分析12LO mRNA序列，确定GUC的位置。
孙仑泉等认为将核酶切割底物的靶位点设计于起始密码子附近，所构建的核酶在体内将有较高的活性。我们在12LO上找出离AUG*近的GUC位点（92位），以此为核酶*佳切割位点，使其能*有效地切割12LO ，阻断12LO的表达。核酶识别区碱基配对的长度及类型（GC或AT配对）直接影响到核酶的特异性。因此设计核酶时，适当加长识别区两侧侧臂碱基配对的长度，图1示所设计的核酶（Rz）及其在12LO mRNA作用的位点。通过Rz催化中心20位的G改变为U ，作为没有切割活性的突变核酶（mRz），以之为对照（图1）。
2.2核酶基因的克隆通过粘端连接将核酶插入到pGEM3Zf（）的SalI位点。酶切鉴定筛选出阳性克隆。挑选出几个重组质粒进行序列测定。筛选出特异性切割12 LO mRNA的核酶基因克隆（pGEM Rz）。其全长序列与设计的序列一致，处于T7启动子下游。
2.3核酶体外活性测定核酶对12LO mRNA的体外切割活性测定表明在生理温度37℃下， 100 nmol/ L核酶与过量的不同浓度的底物混合，保温1 h（见图2）。核酸能有效地切割12LO RNA片段，且随着底物浓度的增加，切割产物也随之增加，而底物自身保温（图21）及底物和mRz混合保温（图28）无任何切割物产生。
浓度的底物反应的结果（下图）。
我们用100 nmol/ L核酶与过量底物混合测定了不同时间下，核酶对底物的切割作用（见图3）。根据1期刘灿辉等：特异切割12脂加氧酶m RNA的核酶体外活性及动力学研究我们试验了100 nmol/ L核酶与过量的不同浓度的底物混合，检测了所设计的核酶在50℃对12LO mRNA的切割活性。图4显示的结果表明，50℃时的Rz切割活性比37℃时高得多，通过Hanes作图法（下以上结果表明，我们所设计的核酶具有极高的在体外切割活性。目前我们已将该核酶连接到pSV质粒上，并试图导入红白血病细胞（HEL），以检验其体内切割活性。
致谢衷心感谢王小凤研究员和庄蔚华小姐在准备本文中给予的帮助。
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