核仁是普遍存在于真核细胞间期核中的*显著结构，它是rDNA转录和核糖体亚基组装的场所。由于低等的真核生物之一。*近研究发现，没有核仁的贾第虫，却具有参与真核细胞核仁前体RNA（precursor RNA）合成加工的同源基因，即核仁功能性蛋白KRR1基因。核仁pre-RNA合成加工是非常复杂的，由大量的蛋白因子参与，其中被详细描述过的有核仁纤维蛋白、核仁素及NOP52等，而KRR1蛋白在贾第虫体内的确切生理功能尚不十分清楚。如果通过改变贾第虫体内KRR1基因的表达来观察对贾第虫的影响，也许对了解KRR1基因在贾第虫pre-RNA合成中的作用可提供依据。本研究拟将两端携带不同长度的反义KRR1基因的锤头状核酶插入到犬贾第虫病毒（Giardiacanisvirus，GCV）转染载体中，构建核酶嵌合型犬贾第虫病毒载体，其体外转录体经电穿孔方法转染犬贾第虫，通过犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因mRNA进行切割，从而抑制KRR1基因在犬贾第虫体内的表达。为了确保体内转染抑制试验的可行性，首先对犬贾第虫病毒转染载体介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果进行了研究。
材料与方法1犬贾第虫携病毒株2质粒和载体贾第虫病毒转染载体。载体pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司。
3主要试剂培养基所用试剂为美国Sigma公司产品，T7体外转录试剂盒为美国Promega公司产品。大肠埃希菌DH5a株为本室保存。DNA片段回收试剂盒、焦碳酸技术发展中心。
4引物的设计与合成根据磷酸丙糖异构酶（Tim）、锤头状核酶、载体pGCV631/GFP/GCV2174以及核仁功能性蛋白KRR1基因序列特征，设计下列引物。
其中有下划线部分为锤头状核酶，斜体带下划线部分为T7启动子。引物及探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。
5犬贾第虫滋养体总核酸的提取取纯化的犬贾第虫滋养体2X07个，加入裂解液，液氮冻融3次（液氮中冻5min，23 56*C水浴2h，用酚/三氯甲烷抽提总RN4上清加1八0体积乙酸钠（3mol/LpH5.2）和2倍体积的冷乙醇，-20C冰箱中放置2h，4C12000冷离心30min，用70%冷乙醇淋洗，倾去上清，用滤纸吸干，真空抽吸24min，加入50ul无RNA酶水溶解核酸，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，-70C保存备用。
6目的基因的扩增按下列顺序对目的基因进行PCR扩增，反应条件为：取模板1ul，10>PCR缓冲液5ul，脱氧核苷三磷酸（dNTP）各2.5mmol/L）4ul，上、下游引物（10pmol）各1ul，Taq酶（5U/ul）1ul，加ddH2O至总体积50ul.反应参数为：变性94C1min，退火57C1min，延伸72°C1min，30个循环后于72*C延伸10min.1.0%琼脂糖凝胶电泳后，用试剂盒回收PCR产模板/上下游引物/目的基因，依次为：犬贾第虫滋养体总核酸/TF1，TR1/TL1；犬贾第虫滋养体总核酸/TF3，TR3/TL3；犬贾第虫滋养体总核酸/KRR1F，KRR1R/核仁功能性蛋白KRR1基因；7重组质粒的构建将扩增的PCR产物分别与pMD18-T载体连接即均用XbaI进行单酶切，回收pGCV634/GCV2174线性化载体和TL2、KL2、KRR1及KS片段，通过T4DNA连接酶将pGCV634/GCV2174线性化载体与TL2、KL2、KRR1及KS片段分别进行连接即得重组质粒pGCV631/TL2/GCV2174 4对引物分别进行PCR，鉴定插入片段的正反向，保留反向插入重组质粒。
均用ClaI进行单酶切，回收PTL2、KRzL2线性化载体和TL3、KL3片段，通过T4DNA连接酶连接即得重组质粒pGCV631/TL3/TL2/GCV2174（KRzL），以此重组质粒为模板，用631F和KLF3、631F和TF3两对引物进行PCR，以鉴定插入片段的正反向，保留反向插入的重组质粒（、）。
8体外转录用扩增的T7K基因和重组质粒KRzS、KRzL、PKR及TRzL经NotI酶切线性化后作为模板，应用T7体外转录试剂盒进行体外转录，37*C反应30min，加1ulDNAse消化DNA模板后，电泳观察转录结果，并进行定量分析。
9犬贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶切割KRR1基因体外转录体活性的检测9.1犬贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶体外切割KRR1基因体外转录体将制备的KRzS、KRzL、PKR及TRzL的转录产物RNA与T7K转录的RNA以分子1：1的比例混合于50mmol/LTris*HCl（pH8.0）溶液中，95C3min，37C5min，室温下轻轻离心后再37C5min，*后加入MgCl2至终浓度10mmol/L，37C3h启动切割反应，同时设立阴性对照。
9.2标准曲线的绘制取9>406pgT7K转录的产物KRR1RNA，以随机6核苷酸为引物进行RT反应（20ul），用稀释液将cDNA溶液按1 1、110、11021108梯度稀释，各取2ul在荧光实时定量PCR扩增仪（型号：ABIPRISM7000，美国）上进行PCR反及9）40-2pg的RNA反转录得到的cDNA量，每个梯度设3个重复。
9.3犬贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶切割KRR1基因体外转录体活性检测切割反应完成后，以随机6核苷酸引物进行RT反应（20ul），各取2ul进行实时定量PCR反应，用以检测锤头状核酶切割KRR1基因体外转录体的切割效率。
结果1目的片段的扩增通过PCR扩增，均得到了与预计大小一致的目的片段（）。
2重组质粒的构建4）。重组质粒KRzL、PKR、TRzL、KRzS均用Xbal进行单酶切，并用631F和KLF3、631F和KRR1F、631F和TF3、631F和KSF等共4对引物分别进行PCR及正反向鉴定（），均证明获得了反向插入的重组质粒。
3体外转录用目的基因T7K和重组质粒KRzS、KRzL、PKR及TRzL经NotI酶切线性化后作为模板，应用T7体外转录试剂盒进行体外转录，电泳结果显示转录RNA完整（），符合转染条件。定量分析显示T7K、KRzS、KRzL、PKR及PKT转录RNA浓度分别为9.0、8.9、重组质粒体外转录4犬贾第虫病毒载体介导的锤头状核酶切割KRR1基因体外转录体活性的检测4.1标准曲线的绘制本试验检测到KRR1RNA0.0900 000pg相当量的cDNA.标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.997，在实验浓度范围内能够进行准确定量。
4.2切割效果检测结果显示KRzS、KRzL体外转录RNA对KRR1RNA的切割效率显著，分别达到74.0%和81.1%.而PKR对KRR1RNA反转录的影响较小，RT-PCR效率仅降低12.0°%，TRzL对KRR1RNA反转录几乎无任何影响（）。
犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因体外转录体切割效果贾第虫病毒（GLV）是专性寄生于贾第虫体内的病毒。GLV具有高度宿主特异性，GLV及其cDNA体外转录体具有感染性，小而稳定、易于纯化，感染效率高，每个细胞可达105个而不影响虫体正常形态，对细胞生长无毒性。因此以GLV建立一种RNA病毒转染系统或一种真核表达载体具有明显的优点。近年来反向遗传学技术的兴起为贾第虫病毒载体的构建提供了技术保障。核酶是一类具有酶特性的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二脂键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的表达。核酶种类较多，其中锤头状核酶与发夹型核酶分子较小，结构简单，人工设计容易，应用较广。锤头状核酶是由11个保守的核苷酸组成的催化核心以及3个由互补碱基构成的茎（I-AI）。根据茎I和I的不保守性，可以设计出具有保守性的催化核心和茎，以及两端与特异性底物结合的侧翼序列锤头状核酶，该酶起反式切割作用。
所必需，虫体无氧代谢的原动力，虫体对甲硝唑敏感的原因等，将编码带有不同长度反义PFORmRNA的核酶cDNA克隆至贾第虫病毒载体（WB株）PC631pac中，在导入转染细胞中表达R酶来切割PFORmRNA从而阻断PFOR基因的表达，该研究首次证明贾第虫病毒载体能够用于贾第虫蛋白质的功能性研究。目前以贾第虫病毒改造的载体系统已成功应用于外源基因的表达，基因结构和功能分析、蛋白质功能性研究等各个领域，显示出广泛的应用前景。
本研究根据锤头状核酶的特点和设计原则人工合成了一个由23核苷酸组成的锤头状核酶，其中茎I和I设计成不同长度的反义KRR1臂，将编码带有不同长度反义KRR1mRNA的锤头状核酶cDNA克隆至犬贾第虫病毒（GCV）载体中，在GCV基因cDNA的5'端634核苷酸和3'端2274核苷酸之间插入绿色荧光蛋白基因（GFP）构建PC634GFP.把23个核苷酸组成的R酶功能区插入不同长度的KRR1反义RNA之间，以在特定位点（50809）切割虫体KRR1mRN―种是短反义序列，上游21个碱基，下游21个碱基，形成R酶KRzS；另一种是长反义序列，上游288个碱基，下游507个碱基，形成R酶KRzL.另作两种阴性对照，一是TRzL，含虫体磷酸丙糖异构酶mRNA的两个片段，上游324个碱基，下游380个碱基；二是反义KRR1，仅有KRR1mRNA的反义片段而无R酶功能区。应用荧光实时定量PCR方法检测嵌合型锤头状核酶体外对KRR1基因体外转录体RNA切割活性，结果显示KRzS、KRzL体外转录体对KRR1基因体外转录RNA的切割效率显著，分别达到74.0%和81.1%，而对照组几乎无切割活性，表明锤头状核酶对目的基因mRNA的特异有效切割结构要素为核酶两端必须携带反义目的基因序列，其长度对切割效率似乎影响不大。本试验为以后进行体内犬贾第虫病毒介导的锤头状核酶对KRR1基因表达抑制试验提供了依据。
