丙型肝炎病毒特异性核酶细胞内切割活性的研究解放军302医院病毒室（100039）杨健洋洪世雯貌盼男梁勇鞠连才胡燕提要设计合成针对丙型肝炎病毒（HCV）核心区基因（第384―386nt）的锤头状核酶（Ribozyme， Rz），从丙型肝炎病人的血清中提取HCV RNA，经RT―PCR扩增HCV基因片段（bp），作为核酶的靶序列，将核酶基因和HCV靶基因片段分别克隆人反转录病毒载体pLXN中构建重组载体，并用电击法分别转入包装细胞PA中，将上述两种转细胞释放到培养液中的含Rz的假病毒颗粒和含HCV靶基因的假病毒颗粒混合后，共同感染空白的PA细胞，被感染细胞维持液的RT PCR结果表明，无HCV靶基因产物即无靶基因的假病毒颗粒释放至维持液中，证明Rz在细胞内有切割HCV靶RNA的活性。
丙型肝炎病毒（HCV）是引起肝炎的重要病原，常导致肝硬化和肝癌，至今尚无十分有效的治疗方法。核酶（Ribozyme，Rz）是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可以特异性切割RNA序列。近年来已研究了Rz对多种病毒如HIV、HAV、HBV等的体外切割活性，我们设计合成了作用于HCV核心区第384―386nt的锤头状核酶，经RT―PCR测试初步证明其在PA细胞内对HCV靶基因有切割活性。
1材料和方法1.1载体、菌株和细胞系载体pLXN和大肠杆菌DH5α为本室保存， PA细胞由302医院生物工程室提供。
1.2工具酶和主要试剂工具酶和质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒均购自Promega公司。RT―PCR试剂盒购自北京博大生物制品公司。
1.3核酶的基因设计、合成依据发表的HCV基因组序列及锤头状核酶基因序列〔5〕，设计切割位点在HCV RNA核心区第384386nt的锤头状核酶Rz386（图1），人工合成相应于Rz386的正、负两个片段（赛百胜生物工程公司合成）各52个nt ，一条链5′端含EcoRI酶切位点，另一条链5′端含BamHI酶切位点（图2）。把两条链等量混合，做5个循环的EcoRI和BamHI酶切位点的核酶Rz386基因片段，经酚氯仿抽提、乙醇沉淀，用EcoRI和BamHI双酶处理，纯化后待用。
↑5个循环PCR扩增期1.4 HCV靶序列的获得依据发表的HCV基因序列，设计合成含EcoRI和BamHI酶切位点的两对巢式RTPCR引物。
其中引物P3有EcoRI酶切位点， P4有BamHI酶切位点。
从HCV患者血清中提取RNA模板，经RTPCR扩增获得nt的HCV靶基因片段（位于基因组第23nt nt），扩增产物用EcoRI和BamHI双酶消化，纯化后待用。
1.5核酶和HCV靶序列的克隆载体pLXN经EcoRI和BamHI双酶消化后，电泳回收大片段并纯化，用T4 DNA连接酶分别与经双酶消化的核酶及HCV靶基因片段定向连接，获公司生产的GenePulser电穿孔仪将它们分别转入DH5α菌中。筛选获得阳性克隆菌，扩大培养，提取质粒，用PE公司ABI型DNA测序仪测序。
1.6核酶和靶基因转染包装细胞PA分别提取pLXN Rz386和pLXNHCV两种重组载体。收获对数生长期的C/ml，用冰浴的无菌PBS洗两次，重悬于冰浴的无菌PBS中，用电击法将PLXNRz386和1.7细胞内Rz切割活性的测试转染后的PA细胞培养，长成单层后细胞。于32℃、5CO维持液（含5小牛血清的1640培养液）中维持6天（每2天换液一次），PARz386和细胞的维持液中。将含PV Rz386和PVHCV的第3次维持液混合，感染空白的PA细胞，并以含PVHCV的第3次维持液单独感染空白PA细胞作为对照。于37℃、5 CO培养1天后，换新维持液维持6天（每2天换1次液），收集第3 587bp.1琼脂糖电泳检测扩增产物的量，判断细胞内Rz的切割活性。
2结果2.1 Rz和HCV靶基因的合成人工合成的3′端互补的两条Rz寡核苷酸片段，经PCR扩增5个循环后，获得85bp的cD NA，经EcoRI和BamHI双酶消化产生两端为相应粘性末端的Rz386基因片段（图2），以血清HCV RNA为模板，做巢式RT 2.2 Rz和HCV靶基因的克隆从重组载体pLXNRz386和pLXNHCV转化的阳性菌中提取质粒，经DNA测序证实重组载体中分别含Rz386和HCV靶基因序列。
2.3细胞内Rz的切割活性（图3）一孔是分子量标准，第二孔是对照实验（PVHCV单独感染空白PA细胞），可以看出，于587bp处有一条明显的PCR产物带，第三孔是PVRz386和PVHCV混合共同感染的细胞维持液，未见扩增产物带，初步实验结果表明， Rz386在PA细胞内有切割HCV靶基因的活性。
3讨论锤头状核酶是目前已知分子量*小的核酶中，它包括催化部分和结合部分。催化部分十分保守，由22个nt组成，或A）的3′端，结合部位位于催化部分的两侧，其碱基同靶RNA切点两侧的碱基互补。我们选择HCV核心区*靠近起始位点（第340nt）的第384～386nt为靶位点，设计合成了锤头状核酶Rz386 ，研究了其在细胞内对靶RNA的切割作用。
由于目前尚未建立敏感、稳定的HCV细胞培养系统和全基因组转染细胞系，使抗HCV研究受到了很大限制。为测试核酶抗HCV作用，我们首先做了细胞外转录试验〔6〕，证实了针对HCV核心区的核酶Rz386在细胞外有切割HCV靶基因活性。本文则进一步研究了核酶在细胞内的切割活性，证明其在PA细胞内对HCV靶基因有明显的切割作用。该试验结果为HCV感染的治疗提供了新的途径。
参考文献3.毕胜利，等。中国人丙型肝炎病毒基因组的一级结构及其变异。病4.成军，等。丙肝病毒的分子生物学。现代肝炎病毒分子生物学。北京：人民军医出版社， 1997：44 5.彭朝辉，等。核酶及其在基因治疗中的应用。基因治疗基础与临床。北京：中国科学技术出版社， 1994：162 6.梁勇，等。核酶体外抗HCV作用研究。基础与临床病毒学会议。香（19990226收稿19990825修回郭醒华编辑赵淑艳校对）
