生物化学与生物物理学报丙型肝炎病毒被膜蛋白1信号序列的切割受下游序列的影响朱立新孔英汪垣李光地中国科学院上海生命科学研宄院生物化学与细胞生物学研宄所，海2，03构中信，序列的切割效牟发现信号斤列下游们或2序列缺火嘤降低71代序列郝加工的效丰1将被膜蛋1.序列12换成长度扣的1！。1乳糖，1序列后也降低位点的胳效幕序列的切割与下游相对完整的被膜蛋白12序列的存在有关。计算机辅助分析发现1信号序列是个很典型前仅发现存在于2信号序列加工和黄病毒，肘位点，1.厘信号序列的加工。由于黄病毒和；均属黄病毒科，这种在同科内具有相类似的异常的信号序列加工其生物学意义值得深入研究！
丙型肝炎病毒出是属黄病毒科的种正链只财病毒，其基因组编码种3000多个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白由病毒和宿主编码的蛋白酶加工为种病毒蛋白5.多聚蛋白的端含3种结构蛋白核心蛋白，被膜蛋白1和2.
由宿主内质网上的信号肽酶催化完成其剪切加工。li5p7S2mS4，S4B，S5，VfllS5l；则由宿主信号肽酶和病毒编码的蛋白酶共同完成剪切加工，目前还没有个肓效的1姑4增殖系统，对1蛋白质结构和功能的研宄主要依靠基因工利技术达0的蛋3质来进行。达讯多聚蛋白时发现，蛋白质的成熟效率很低，产生很多未成熟的前体H研宄HCV蛋白质的达和加工对于了解病毒的生活史以及的防治具有重要意义。在痘苗达系统中曾观察到编码阳2结构达的1比编码心羧端缺失纳构达的1迁移率反而大。显邻近序列对们成熟加工的影响本文通过比较信号序列下游不同缺失的达结构，发现该信号序列完全的切割加与下游相对完整的被膜蛋白12序列的存在有关。若信号序列下游以半乳糖苷酶序列替代被膜蛋白序列，也降低了该信号序列的切割效率。
1材料和方法136土8 1.1细胞株和病谢朱中培养。在痘苗病毒早晚启动子，7.5控制下达丁了噬菌体只默聚合酶的重组痘苗病毒丁丁由本组构建和保存。噬斑形成单位1叫18出1忮，1血滴度测定在831细胞上进行。
1.2质粒构建痘苗病毒171！动子达载体山美，人由北京人学十宇教授提供，8如10934.1是构建的，达质粒的意。含完整的01和至2的661位氨基酸的去除2羧端疏水序列后得到。质粒21 73以，和召，酶切，40聚合酶处理产生平端后自连得到含完整的，椭痢瓯的341位3酸的达质粒1尤以1341.去除人部分1序列的达质粒12出9咎395661以国家高技术863计划资助项目，8631020702021氨端的9个核苷酸，其余为2蛋白的氨端序酶解的质粒21661中得到含完整0基凶并通过1信号序列连接2至661位氨基酸的达质粒尤094394661.在位点下游融合了化7基因的达质粒，7的构建如下。基因来自质粒，3065由美国1.出麻士提供，1父65用，1酶切1经1酶补平，再以5，酶切，回收，2，闪片段。质粒1341叫1酶切后补平，再用6瞧1切，和上述基因片段连接得到1妃10，我体1用，酶切后补平，再用5坐。1切，和上述基因片段连接贝得到对照质粒。上述质粒均经测序验1.3在疸苗77人聚合酶达系统进行暂时达培养的心细胞用重组痘苗病毒17感染以达17奶人聚合酶。感染2后，用脂质体001仙士产品为载体，按该公司提供的方法进行达质粒的转染。转染24后，收获细胞进行免疫印迹评68时，0分析或储存。80C免疫印迹68阳印迹分析转移至硝酸纤维素膜8土161.3，6产品。
该膜以508脱脂奶粉封闭后，先后与第抗体和1000倍稀释的出蛋，6尽则产品温育，统进行色检测，所1的第抗体右坫人血清394北京大学王宇教授提供，1500稀释；抗，核心蛋白单抗贾也0，6，6吁产品，1.5半乳糖苷酶活性测定3半乳糖世酶活性测定主要依据文献并作了呜改动。丁丁7感染质粒转染的1细胞经取上清进行酶活性测定。空白转染的细胞裂解物上清用作测42，1吸光度的空白对照为检测细胞碎片中的半乳糖苷酶活生，细胞碎片用，洗涤两次后，姑于1001防中则活性时在样品和底物的保温过程中不时振荡混匀。
2结果和讨论只681山8 31801邮，2.1质粒构建和目的基因的达痘1病毒丁7达系统是利高效的17启动子在真核细胞中达目的蛋白夂我们以1心河1为载体构建了多个含不同结构蛋白基因片段的屯组达质粒，经7感染的，3细胞转染这些达质粒后，用与同源的病人血清594对均检测到报强的2山左右的，核心蛋旧士代成熟的1核心蚩门！。1此和，17样品中可检测到3半乳糖苷酶活性2.21信号序列的切割加工依赖其下游序列从2入中可以看到，当用病人血清394检测时，达的0结构蛋白质呈现很多条带，除了部分为非特异条带外，也明达产物翻译后加工的效率较低。为研究这些不均条带的性质，我们用抗，核心蛋白单抗对达产物进行了1.1印迹分析由2；可以打到，达连续条带比例较小作达连续的1斤列的1王341样品也检测到成熟的2左右核心蛋白，但另在351左右处还检测到很强的特异条带。由于1核心蛋白不存在糖基化等翻译后修饰，和核心蛋白单抗反应的该条带大小和预计的，1连续多肽长34133的大小致，因此代了未加工的01多肽1山，等4在痘苗病诉系统中达，结构蛋白质时也发现在使用1抗体对产物进行检测时。仅达抓核心蛋白和340和1382的重组病毒，与达更长下游序歹，1906的重组病毒相比，1产物的迁移率反而低。这些现象明1信号序列的加工受1下游存在的相对完整的2序列的影响。
般认为，1的信号肽位于核心蛋白羧端氨基酸第175位至191位9.而且有证据明，信号序列下游的4个氨基酸影响信号肽酶的功能1.
为了进步研究下游序列对1信号序列切割加工部分的序列，将第194位氨基酸和第394位氨坫酸相接，得到132194394661由于第195位和第394位是同种氨基酸，我们保留了信号序列下游的4个氨基酸序列。该质粒的达产物除了有成熟的核心蛋外，也检测到较强的核心蛋白单抗特异的前体条带，其大小明是未切割完全的2多肽从然。和21661相比，信号序列下游被膜蛋白1序列的缺失也导致1信斤列加工效率的降低序列的影响。为了解此现象是否直接与下游存在的相对完整的被脱蛋12序列相关，我们用，基闪替换了游的幻12序列，将，基闪接在1信号序列的下游，构建了核心蛋白基因和基因的融合达结构。达产物和被膜蛋白大小相当，且保留了信号序列下游的4个氨基酸。在该质粒的达产物中也检测到成熟的核心蛋白，同，还检测到核心蛋白单抗特异的分子哞在120左右的蛋白质，和预计的未切割的半乳糖苷酶融合蛋白大小相符合。半乳糖苷酶活性测定实验实了此结构信号序列加工效率较低如1所，在！河12转染的细胞裂解液中检测至1很高的半乳糖苷酶活性，这与17启动子的高效特仅检测到很低的3半乳糖苷酶活性，该样品中的3半乳糖苷酶活性大部分存在于细胞碎片中。对照1河1样品中没有检测到任何半乳糖苷酶活性。
可能的解释是，疏水性很强的核心蛋白序列将半乳糖苷酶锚定在细胞膜上。由于3半乳糖苷酶是1个亚基蛋白，分离的半乳糖苷酶很可能大部分通过和未加工的融合蛋白形成聚体而留在细胞膜上。
2.31信号序列的结构分析很多证据显1序列上游有个信号序列。
第，基因工程达的El是种静态滞留于ER膜上的糖蛋白135.第，以192位氨基酸作为1的第个氨基酸时，上游序列具有典型的信号序列的特征3和1位氨基酸即，多聚蛋白第189位和第191位都是丙氨酸，符合不带电小氨基酸的3，1规律；同样重要的是，第188位氨基酸是个破坏螺旋结构的脯氨酸，信号序列中存在着个疏水的典型的1区15.当genome.dS.dtU.dk对El上游序列进行分析时发现，氨基酸序列第176位至第186位代了个典型的信号序列1区，氨基酸序列第187位至第，位满足区的要求即靠切割位点的上游还有小段亲水的氨基酸片段3.将个蛋白质无关1.然而，我们在研宄口1位点切割时发现El信号序列的加工是很不寻常的，下游被膜蛋白序列显著地影响了该位点的切割效率。有报道在研宄2的信号序列加工时发现了相似的现象1引人注意的是，黄病毒，位点洲信1序列的切割效率也受到上游和下游序列的影响由于，ず突撇就，艋撇究疲，庵衷谕，徊，毒科内具有相似的异常信号序列加工，其生物学意义值得深入研究。用其他来源的信号序列替代1信号序列，研究其加工规律，将有助于阐明，1信号序列对其加工的影响对，1信号序列及其他黄病毒科蛋白信号序列的加工进行深入的比较研宄，有可能阐明这类信号序列加工上述结果有助于深入了解0结构蛋白质在翻译后加工过程中相互作用的规律，还提！
各结构蛋白质的达不是孤立的过程。深入研兄可能发现各结构蛋白质达调控之间的联系此外，研宄结构蛋白质的加工规律对了解病毒粒子的装配病毒的生活周期，以及应用于基因工程达体系中效达，结构蛋白质等方面，无疑都是十分有意义的。
4755引自中国科学辑
