核酶在细胞外切割1核心区锢人的研究广片龚㈤忠郑宣鹤游学科蓝色及白色菌落生长；核酶重组质粒直接测序结果预期核苷酸序列；重组质粒限制性酶切分折4条带。衿酶以1反应1心反时间为430，可453.307146条带；反间为6；时仅307及146付2条带。结论核酶重组质粒构建成功，所设计核酶对0有切割作用，主词核酶；肝炎病毒丙型；基因治疗乙甩和丙型肝炎易发展为慢性肝炎肝硬化肝癌及终末性肝衰竭而倍受重视。目前认为抗病毒基因治疗极有可能为治疗病毒性肝炎带来新的希望。核酶是类具有生物催化活性的小分子服入，能以酶的效率催化切割目标，作为基因治疗的种方洗核酶己显其独有的潜力。在本研究中，我们计付核心邮因设计核酶，建；核酶的，嫩重组质粒，并通过体外转录得到核酶及HCV！反，在定条件1将者浞合温肓以基金项目国家自然科学基金资助项目3967067国忠课负责人，郑宣鹤，湖南医科大学附属第医院医学实验中心分子生物室游学科进行反应并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影观察核酶对班的切割作用，为进步研究核做叫狂复制打坫础，并探讨核喻成为治疗感染新途径的可能性。
材料与方法左要试剂碰72+载体大肠杆菌厕109株各种限制性内切酶修饰酚516；1聚合酶反应试剂盒下7聚合酶反应试剂盒购朽。，公司；人1购自北京亚辉生物工程公司。中国湖南株丙型肝炎病毒核心区基因1迫30688与19只质粒屯组体转染的大肠杆尚，而109株由湖1初写科大学湘雅医院谭德明教授惠赠，核酶反应缓冲液5父按1也1士0等的方法配制，含18通信作者丁芳。221002徐州医学院附属医院传染科，高温高压消毒后备用。
只核酶重组质粒的构建筛选及分析选择沉核心区；1以时412414为核的靶位点，在侧序列的两端分别加上1荆，弧降，1刀位点。核序列为5VGAATTCCGGGCGGTGGITO；IX活性部位；活性部位两侧为与讯互补的侧翼序列。述核酶1.1膣，列及其互补链山北京赛1盛美国公司人工合成。讯核心区核酶必敝重组质粒的构建筛选纯化及鉴定参照文献3进行。
嚷组质粒进行直接测序由北十戏百盛美国彡生物程公司在自动测序仪上完成。
只0核心区基因的提取亚克隆筛选纯化及鉴定参照文献3进行。
核酶在细胞外切割HCV及分析分别将上述核心及核酶，重组质粒以限制性内切喻切开线性化，进行体外转录，得到0核心区基因以及今心区核，心，几体操作按办公司的体外转录系统技术手册进行。在适当条件下将者分别在37，混合温育153，及0如以进行核酶切割讯反应，并。独将，1抓反应缓冲液混合温育以排除非特异性降麻各温育过程中均加入说酶抑制剂以排除刚人酶的降解作用。
后约338处衫长，各。长带分，为超螺旋环状带切口环状线状的0核心区基因重组质粒及未连接上，核心区基因的超螺旋环状带切口环状线状等形式。重组质粒经，1及1切后为2 97及4，处2条297，处为刚7+载体，4处为核心1基因及部分叹19只的衫克降位人。1约5冬通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影分析结结采1.只核酶及只核心坫闪屯组质粒的构建筛选分析半乳糖苷酶型蓝白筛选可以2.核酶在体外切割讯分析混合温育时间为时间为630714乩2条带。说明1530时切割不完全，60，时切割完全，2.
1寸论看出转化后生长菌落为白色或蓝色，其中白色为重组质粒转化的细菌，蓝色为非重组质粒转化的细菌，而未经转化的细菌对照因培养基含氨苄青霉素，无细菌菌落4长直接测斤鉴定核酶。1屯纟质粒显第130到82位核苷酸与核酶出，互补，第81位核苷酸以前的序列。1刚7+滕相同。说明核酶出1从序列1经插入；碰7苏+质粒的，和顶铰刀位点之间，切后为282及4处2柬2812处为成只载体眺处为沉，核心区基闪及部分1719只的克隆位点约51如。
自1990年美国批准了世界上第例基因治疗人体试验以1以腺作酸脱，酶缺乏症的人体基因治疗为先导，人类基因治疗计划以异乎寻常的速度发展。核酶技术的发现和应用是反义技术的个重大改进，核酶册从不仅可以像反义那样与！结合，阻断其转运剪切加工以及翻译复合体割，且这种切割具有酶学性质效率较高，尤其是多付高突变病毒基因组的有效方法。它不仅破坏了病毒蛋白翻译的模板，也同时破坏了逆转录的模板。
己经发现的6种肝炎病毒中，除趴外，其余5种都是酿病毒。8虽是0，病毒，其复制环节和复制机制在许多方面又像逆转录病毒。因此，核酶在6种肝炎病毒的基因治疗中都有用武之地。核酶的结构主要有两种，即锤头状和发夹式。核酶的侧翼序列可根据任何目标合成。核酶作为种新的基因治疗方法，目前己引起广泛的关注。其抗1研允己进入临冰试验⑷取也汀报逍抗的报道则较少，国内尚无核酶抑制的报道。在本实验中，我们设计了种针对核心区们所使用的湖南地1内肝病毒核心基因足中国型的丙型肝炎病毒之，通过基因的分析比较，它类似于曰本分离的而不同于0美国株7.
丙肝病毒核心区蛋白高度保守，有免疫原性，在1末端包几个线形的纟1胞及位，被广泛应十病人血清的抗体检测9.核心足丙刖娲谭*基本的蛋白，在它的端有个疏水区，是1转移至内质网的信号，而且对于细胞核的膜依赖过程是必须的。核心区还有结合的活性。这些研究提，核心区对细胞功能有不利影响，可能是此，我们选择核心区作为核酶攻击的靶位。
我们在用核酶重组质粒转化感受态大肠杆菌脚9株的过程中看到蓝色和白色的菌落，白色菌落直接显了我们设计合成的核酶己插入到172质粒的，尺和抓1酶切位点之间。Ha核心K基μ寺±懂l筛选的结果Mj样说明核心基因亚克隆成功。限制性酶切分析到了预期条带也证明了这点。核酶，人切割反应的结果，到倾，的307及刚条带，且反应，间为6，士，453处条带消失。这不仅证明了所设计核酶对有切割作用，而且，在60时可将目标，人完全切割。
核酶的出现开辟了从分子水平治疗疾病的新前景。它可以不可逆地使目标失活，可在体外循环利用，而且催化效率较反义寡核苷酸明显提高。随着多位点核酶腺病毒相关载体化学修饰及阳离子脂质体等的应用及对核酶研究的进步深入，有关病毒变异核酶在活体内的毒性及活性等问都将迎刃而解，核酶将成为。叫1.高效的抗坫，药物。
3上萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著。金冬雁，黎孟枫译。分子克隆实验指南。第版。北京科学出版社，1996於7谭德明，胡国龄，谢玉桃，等。丙型肝炎病毒核心和略3蛋白质片段的达和应用。中华微生物学和免疫学杂志，1993收稿日期19办102
