植物染色体显微切割技术及其应用综述何风华华南师范大学生命科学学院，广东广州510631分子标记辅助育种是现代分子生物技术对常规育种的重要补充和发展。分子标记辅助选择的个前提是找到与目标基因相连锁的分子标记。现在，些重，农作物己构建了分子标圮连锁，但这些遗传上标记的分布不均匀，有些染色体区段遗传标记过于稀少，有些区段还有空白，需要发展新的标记以绘制高密度的遗传连锁。利用染色体微切割和微克隆技术建立染色体特异或染色体区带特异基因的1条重要途径。
染色体显微切割技术是由51担1等创立的项分子细胞遗传学新技术1.该技术创立以1乜要用于人类和动物染色体研宄。，尺发叫以微切割和微克隆技水得到了较大发展2.由于以两1方面的原因，染色体显微切割技术用于植物研究起步较晚1植物细胞有细胞壁，细胞质较浓厚，细胞分裂不易同步化，植物染色体制片较困难；2绝大多数植物染色体显带技术不成熟，难于识别每条染色体。但自Sandety等3利用染色体微切割和微克隆技术获得了黑麦DNA克隆以来，该技术在植物遗传与进化研宄上得到了广泛应用。本文对植物染色体微切割微克隆技术及其应用的研宄进行综述。
1植物染色体微切割，尺及微克隆技术染色体显微切割是指在显微镜下将目标染色体或染色体区段从玻片标本中切割和分离出来的技术，微切；微克降技术。要包拈染色体玻广标木的制备染色体的识，和微切割扩助克隆及鉴定等步骤。
1.1染色体标本制备染色体微切割妃项度精细的技术，对染色体标木的要求相当高染色体标木的制作般勾常规方法相同，但要求染色体尽量散开，显带后带纹清晰，易于识别；在制片过程中减少酸碱处理的时以防测受损。邓可京1；4利用醉冰醋为91和31的收固液，通过细胞分裂，化瞬间固定和涂片等制片技术，快速制备了水稻根尖细胞染色体标本。所制备的染色体标本杂质少，龙煞，碰飧今染色体分散程度好，满足了显微切割高质量用片的要求。
1.2染色体显微切割和分离植物染色体的显微切割主要有两种方法玻璃针切割法和激光灼烧法。
玻璃针切割法是在倒置显微镜下进行的，倒置显微镜上装有显微操纵装置，其末端装有直径不超过1的玻璃纤维，来对染色体直接进丁切割，切下的目标染色体或染色体几段用微细玻璃针在45的醋酸中收集到油室内，进行蛋白酶消化等处理，随后将所获得的入用于1扩增和克隆。
该方法是显微切割的主要方法，己在多种植物染色体切割上得到应用，如此吨等5用微细玻璃针分离了野生甜菜具有抗线虫基因的染色体；胡赞民等6用微细玻璃针法分离了玉米单条染色体。但该技术操作困难，不易掌握，在定程度上限制了其应用。
显微切割也可以通过激光灼烧的过程来实现，即激光切割法，先将染色体标本做贴有特殊薄脱个以目标染色体为中心的角形膜，然后用较小功率的激光照射角形膜内其它不需要的染色体，使其蒸发，只保留所需要的染体或染色体片段，回收角形脱，放入0.5离心管内，进行，尺扩，和微克隆的操作。虽然该方法对设备条件要求较高，但由于操作容易，能使染色体显微切割逐渐走向简单化而得到许多研究者的青睐。只等7用激光共聚焦扫描显微镜对水稻大麦等作物染色体进行了切割。我国科学家也成功地利用激光切割法对大麦8小麦9和小冰麦1等作物的染色体进行了切割和分离。
通常，直接切割只能获得10条左右的染色体，只有通过PCR扩，才能获得足够量的DNA用于后续实验。前常用的，扩，方法主要有两种接头适配斤列，0尺1止；60忆1010和入是用人1合成的互补哀聚核苷酸链作连接接头；叩此具粘性末端，选用产生粘性末端的内切酶C所产卞的粘性末端勹连接接头的粘性末端TrJj酶解染色体DNA，然后勹连接接，相连接，利用连接接头的条寡聚核苷酸链为引物进行，扩，扩增产物可直接用于克隆不存在选择性扩，可以保证以后微克隆文库的完整性。
3.他们将，的扩增产物和入，尺进了比较，认为民扩增的方法步骤少，工作量小，但存在选择性扩，问，不利于建立完整的区域性，文库。在植物染色体显微切割技术中，应该**1入孑0尺进行扩1.4特异性DNA文库的建立及其鉴定微克隆的方法*初采用酶切产物直接克隆法旦这种方法的效率非常低，如此等利用酶切产物直接克隆法克隆，蟪笕旧，宓那懈钇，危，钪罩坏玫揭桓鲋刈榭寺＃，呒际跻，胂晕⑶懈詈螅，微克隆的效率大大提高，PCR产物可连介适的载体用来建立DNA文库。现在，植物染体微切割和微克隆的方法基本上都是采用，0产物克隆法。
在站微切割的每个环节都存在染的可能，因而对克降的鉴定非常屯要。鉴定的内容七要包括扩增产物或克隆片段的来源，插入片段的大小，文库中单拷贝低拷贝及重复序列的比例，文库对染色体的覆盖程度等。常用的鉴定技术主要有8，说1咖1杂交，荧光原位杂交18，特异引物的，尺扩增冷。前戏采用刃8，法进行以隆的炫定，2技术的改进2.1切割方法的改进李秀兰等12对玻璃针切割法的装置进行了改进，改用倒置显微镜为普通光学显微镜，先使显微镜物镜焦点平面升高约7，将制在盖玻片上的染色体标本反扣在自制的玻璃台架上，从物镜下方进行染色体切割，这样就解决了在倍油浸物镜下不能切割染色体的困难，实现了在高放大倍数条件下进行染色体显微切割的问，大大提高了显微切割的精度和准确度。宋文芹等13利用这个改进的显微切割装置切割分离了水稻l号染M本，经PCR扩增后建了染色体特异的DNA文库。这种方法实验装置简单实用，在基因组研究中有广阔的应用前景。
2.2细胞质DNA污染的控制植物染色体显微切，过程，心沁1他来源主要存个面1其它物种的染；2非目标染色体的污染；3细胞质DNA的污染。其它物种DNA的污染可以通过仪器设备化学试剂的严格诮谒灭菌来控制1目标染体的污染也可以通过微切割过程中的小心操作来避免而细胞质DNA的污染是个令人担心的问。由于植物细胞的特殊性，在植物染色体玻片标本中不可避免地都会，吖细胞质和细胞壁残智碎片。即等14的研宄樘明，前；的显微1伙染儿广是难以避免的。他们提出个降低纟1胞质刚污染的，法，即在倒迸显微镜辨认出的染色体后，加滴50乙醇，然后用玻璃针进行切割和分离。另外，在，尺扩，的时候使用单条染色体或单个染色体片段作模板，也能有效的降低甚至避免细胞质人污染。
3染色体微切割微克隆技术在植物研究上的应用3.1构建染色体特异的或染色体区带特异的探针池切割的，色体片段经PCR扩，f的产物即为探针池。探针池结荧光原位杂交技术FTSH是研究染色体缺失易位等结构变异的强有力手段。夏家辉等15构建了些人类染色体区带专特性探针池，用于人类基且和遗传疾病的研究。邓可京等4建了水稻4号染色体专特性探针池，许用阳只技术证实了其特兄性，为从水稻单条染fe体的DNA文痄中筛选特兄的分子标记奠定基础。
3.2构建染色体或染色体区带特异的DNA文库染fe体切割后通过PCR扩增获得产物的长度般为15020bp，这uf用j，建特异性的DNA文库。，1前，1出微切剡的法构建整条染色体，文的，勿打乩菜卞米1水稻。1号染色体13燕女21号，fe体ll等，己构建，色体K段特R的DNA文痄的植物有大麦m短臂171大麦阳长臂通小老56长臂19和玉米6号染色体姒臂2，3.3筛选新的分子标记从染色体区带特异的DNA文库入手，能大大提高筛选新分子标记的效率，这对于构建高密度，分布均匀的遗传连锁具有重要意义。3此，等17切割了大麦识染色体的短臂，经微克隆后构建了该区域的分子标记连锁，并筛选到个与抗白粉病基因紧密连锁的处1标记，为该基因的克隆奠定了基础。Busch等18切割分离了大麦3H染色体的长臂，用iteI酶切后连接到MBmp7载体上进行，尺扩增，经克隆后得到个中等重复序列和个高度重复序列，这为植物微卫星标记的分离奠定了基础。田革叉等21以普通小麦钢82122为材料，利用显微切割技术分离了10染色体，经微克隆后得到了高分子量麦谷蛋白0815亚基的基因片段，他们的研究证明用微克隆方法获得利用染色体区域特异的分子标记还能实现遗传连锁和染色体物理谱的相对应。现在应用的分子标记连锁和染色体物理并不是对应统的，有时，两种谱所的距离相差甚远，亦即，遗传连锁上某个分子标记的位置并不是它们在染色体上的实际位置从区域特异的DNA文库中筛选出是沟通遗传和物理谱的中介，这就实现了两种谱的对应和统。
3.4在进化遗传学上的研究1响体区特异的探针池和区带特，测文，为植物进化遗传7和植物比较驻因组学研究提供了新的途径。张荣信等22利用染色体显微切割技术建立了黑麦8染色体着丝粒区的探针池，然后利用FISH技术证明AB染色体着丝粒区域的DNA具有高度的同源性。Houben等p3从构建B染色体和染fc体炒段DNA文库手，研允B染色体的起源和进化，认，B染色体来A染色体，似缺乏A染色体异染色质区主要的重复DNA家族，B染色体上某些高度重复序列在A染色体上也有分布。
染色体显微切割技术是细胞遗传学和分子遗传学相结合的种技术，它在人类基因组和遗传疾病利用微切割和微克隆技术所构建的文库的特异性，对阐明全基因组的结构以及功能基因组学研究必将发挥独特的作用。
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