增殖特性和多分化潜能，已成为中枢神经系统退行性疾病细胞替代治疗的一种理想细胞。本课题组曾将体外增殖的神经干细胞移植于切割穹窿海马伞侧海马齿状回中，结果发现切割侧海马中移植的神经干细胞比移植于非切割侧海马中的神经干细胞更易于存活、迁移和向神经元分化％切割侧海马提取液也较非切割侧海马提取液更能促进神经干细胞向神经元或AChE阳性神经元分化。本研究在切割穹窿海马伞后，通过腹腔注射5-溴-2-脱氧尿苷（5-基金项目：国家自然科学基金资助项目（30670648），江苏省自然科学基金资助项目（BK2006057）：2007-06-18经干细胞DNA中，然后应用BrdU和神经元标志物光双标技术，观察切割侧和非切割侧海马中自体神经干细胞增殖和向神经元分化的情况。
1材料和方法1.1切割大鼠穹窿海马伞中心提供），雌雄各半，复合麻醉剂chlorpent0.2ml/100g体质量经腹腔麻醉后，将其固定于立体定位仪上，无菌条件下暴露前囟，确定前囟坐标A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴），根据Paxinos图谱确定右侧穹窿海马伞的切割范围。先在颅骨上确定两点，即（1）A1 4，切割深度为Vu=V+5.4.用刀片在两点间将颅骨划开1条骨缝。将针刀插入脑内至切割深度，左右来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后，缝合皮肤，肌注青霉素，按性别分笼饲养。
穹窿海马伞切割术2d后，动物腹腔注射BrdU（Sigma公司），BrdU用0.85%生理盐水稀释成5mg/ml，按50mg/kg剂量注射，每天1次，连续5d. 1.3切片制备切割术后28d，经升主动脉先后灌注生理盐水和含4%多聚甲醛的0.1mol/LPBS（pH7.2）400ml.取脑，后固定4h，再先后转入4*C含20%和30%蔗糖的0.1mol/LPBS（pH7.2）中平衡至沉底后，行冠状位厚30wn冰冻连续切片。收集海马1.4BrdU/NF-200免疫荧光双标检测每只动物随机挑取海马前、中、后各1张切片，下孵育4h后，加入1：400稀释的鼠抗BrdU单克隆抗体（Sigma公司）和1：200稀释的兔抗NF-200多克隆抗体（Sigma公司）的混合液中，4C孵育72h.充分洗片后，加入1：200稀释的结合有AlexaFluor568荧光素的山羊抗鼠二抗（Molecularprobe公司）和1：100稀释的结合有异硫氰酸荧光素（fluorescein 4C孵育48h.避光条件下充分洗片后，中性甘油缓冲液封片，分别在激发光波长为578nm、吸收光波长为603nm和激发光波长为495nm、吸收光波长为520nm的荧光显微镜下观察BrdU和NF-200免疫阳性细胞的情况，并摄片。
1.5图像处理及统计学分析在放大200倍的荧光显微镜下，分别将同一视野下所摄取的海马齿状回BrdU阳性细胞和NF-200阳性细胞图片，输入电脑中，应用Spot4.6形态学处理软件（Diagnostic公司）进行重叠。然后分别计数每张切片BrdU阳性细胞数和BrdU/NF-200免疫荧光双标细胞数，数据以x*表示。用STATA7.0统计软件，分别对上述数据进行配对t检验。
2结果BrdU免疫荧光标记的神经干细胞核呈红色小亮点，大部分位于海马齿状回的颗粒下层中，约呈条带状分布，在颗粒层中也有少量BrdU阳性细胞，但切割侧的BrdU阳性细胞（A，见封二）明显地多于非切割侧中的BrdU阳性细胞（A，见封二）；NF-200阳性细胞呈绿色，两侧NF-200阳性细胞密度较大，突起丰富（B和B，见封二）；BrdU/NF-200免疫荧光双标细胞的胞核呈红色，而胞浆和突起呈绿色，在切割侧海马齿状回颗粒下层中每张切片能观察到2~3个BrdU/NF-200双标神经元（C，见封二），该双标神经元数量占BrdU阳性细胞数的率为7%左右；而在非切割侧海马齿状回中，均未能观察到双标神经元（C，见封二）。统计学处理表明，切割侧和非切割侧比较，BrdU阳性细胞数和BrdU/NF-200双标神经元数之间的差异均具有高度统计学意义（详见表1）。
3讨论神经系统的发育源于胚胎早期的神经管和神经嵴，发育中的细胞沿着一定的路径迁移，并在局部微环境的影响下进行分化，*后到达相应的功能区。研究发现，哺乳类动物中枢神经系统中自体神表1切割术后28 d海马齿状回BrdU阳性细胞和BrdU/NF.200双标神经元统计结果（x±，n=8>S）切割侧非切割侧t值P值经干细胞主要存在于前脑室下带（subventricularzone，SVZ）和海马齿状回门区。目前已证实，SVZ的神经干细胞可以通过吻侧迁移流（rostralmigrationstream，RMS）迁移至嗅球并分化为联络神经元，而海马齿状回中的神经干细胞则沿着颗粒下层迁移，分化为神经元并*终定位于颗粒层。然而大部分神经干细胞处于休眠“静止状态，在受到病理刺激后，可被激活、增殖，分化为区域特定的神经元的一种再生反应机制。
回多形层细胞的纤维，形成海马的传出系统，形成海马伞进入隔区成为穹窿，止于丘脑前核、乳头体核、隔外侧核及斜角带核等；而大鼠基底前脑隔区内侧隔核和斜角带垂直支中胆碱能神经元发出的突起，又通过海马伞投射至海马，成为海马乙酰胆碱的主要来源。本课题组曾通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，在切割穹窿海马伞侧海马中，较非切割侧出现了较多的差异蛋白，并在体外细胞培养中证实有的差异蛋白可以诱导神经干细胞迁移和向神经元分化。因此，如果能弄清切割穹窿海马伞后海马中复杂的微环境变化，人为地施加一些因素，就可能使更多的神经干细胞增殖并向神经元或特定的目的神经元分化，以达到真正意义上的神经形态学和功能学上的再生。
