简报。
自我剪切锤头状核酶体外切割2的研，侯化杨光彩黄杨中王曙31广州同和第军医大学生化教研室，广州501515；2美国弗吉尼亚大学生物部，美国964 3.上海复旦大学生命科学院遗传学研宄所。上海200092研允证实，人乳头。病！；6±殖是尖锐湿疣发生和复发的*主要病因，其分子机6和7的转录则是1在宿主细胞中增殖的键步螬1.基闪纟1.转氽的。收调节系统位尸tSi.WiiEUstivainregiihloi.yivgio.URSl；拉制区，1；键性的调节蛋1是尺2蛋4，人小常为4548，以聚体形式结合于0贴。由3个功能性结构域组成，全长2蛋白是个典型的反式激活蛋白，以聚体活性形式特异性结合于上游调控区的2结合位点入CGNNNNCGGTACCN6GCT，ftHPYllfflS因组的转录水平提高20100倍。2蛋白是个双功能蛋白。1端截短的12蛋121.乍长2在功能上是拮抗的，它们的比例决定着整个早期基因组的转录状况2.因此我们设想2基因可以成为抑制1感染的尖锐湿疣基因治疗的理想靶点。
核酚足类具耵生物催化功能的从分户，包括1类和类内含子锤头状核酶发夹型核酶核糖体只等3.其中锤头核酶*小，便于操作。
它包括3个茎区和个单链催化中心，通过两个基区和祀只。结合。催化中心识别并切割祀只结合部位的41序列。由于它良好的应用前景，近年来发展自我剪切头状核酶达载体它的设计在理论上减少了与核酶起从载体上转录的序列对核酶活性的影响。因此目前自我剪切锤头状核酶作为种非常有效的手段，己被广泛用于抗病毒抑制端粒酶活性细胞信号传导等的研宄4.本实验根据锤头状结构原理人工设计了对应于2人序列中第3281位点核酶它能够在体外特异性地定点切割靶陬人分子，将靶基因切割成两个片段，起到；1断12复制和达的作用。时研究了它切割底物的动力学性质。
由计算机软件设计出锤头状核酶3281的剪1刀部位，确定所要目的基闪片段后，设计10只引物人1厂段，5，〃1反应体枳中进行斤有1.5，几MgCl2，从连接酶，常规，12厂法导入训9细，经1广；和1筛选色4落。
心1酶切鉴定，提取质粒，测序确定靶愚人序列的确件1.2，1芯2闱41的，0只扩增结果收稿日期200029；修回日期2000228基金项目国家自然科学基金39700187；广东省自然科学基金970332脂糖电泳以尤，1与5士股连接，以炙尸与368驭相连，5士只2与3士门具有自我剪切作用的核酶。以便于克隆于它们之间的目的片段以以独立释⑴而更好地行使功能处大冲段为便于限制酶切后电泳时与载体部分分离而设，无其合成的两条链，人各取等摩尔量，混合后自动退火配付，将如此到的基因序列与。，1和，酶切后的。5载体连接，转化大肠杆4，109，转化成功后取单菌落提质粒，酶切，测序鉴644经心71线忡化17，酚，仿抽提纯化作为转录模板。利用71六聚介酶系统进行体外转录，反应体积20叫转录底物加入的3了137保温2，转泌体忝中含有5，尺1线性化后，同样经上述反应，底物经6聚丙烯酰胺凝胶电泳含7咖尿素，似3281 12备聚丙烯酸氧凝胶电泳，放射自显影，割下放射区，胶。浸泡过力口3倍体积的柃酸浸泡液放置42412.5倍体枳无水乙吣沉淀1爪，7乙醇洗漆，离心弃上清，沉淀溶于适量的腿88666 1胆20，20，呆存备用45.
将靶顺人分子核酶分别与底物按定浓度比混合6似=2加入的切缓冲液200，1 37温育21结束后加入，反应终止液25甲苯蓝，们。切割产物经6变性聚丙烯酰氨凝胶泳，微后。，物鼠分别晋下切点两侧碱基配对的强弱，而可成与底物核酶的结构以及反应条件有关，故不同似的动力学参数有差别5，与普通的蛋白质酶相比，泣的要大说明似的催化活忡较低，7=尖锐；疣。足由抑6型和奶型引起的1性上皮增生性疾病，属性传播疾病。近年来，尖锐湿抚的发病率在世界范围内持续增高，在欧美已是常的病毒性传播疾病之在我。尖锐；1疣的忠亦不断增加。而对其治疗的药物常力局部药物疗法，物理疗法，反义疗法。但都+能特异地抑制病损组织基层抑0熟的复制和达，从而使尖锐湿疣发生和从发1.只，0，从制的分子机制在于坫因稂的复制和达。其中2是关键。因此可以设想2基因可以成为抑制1感染的尖锐1疣基1治疗的理想靶点木文借助计算机软件人工设计合成了似3281核酶，针对2坫因的核酶的分十。使它对厂2，7井行特异性煎切。实验明13.8苟接晶切割产物位置和切割产物位置处的凝胶，测定放射性强度。按下列公式计算切割效率核酶切害率=切割产物入未切割底物人+切割产物入似3281同相应底物片段体外剪切浓度比似8=12反应后，6聚丙烯酰胺凝胶和19聚丙烯酸胺凝胶双层胶电泳产生相应切割条带。将；1 2基因6441中的片段切成4341和210.实验结，农明汁算机设计出的核酶能定点切割，1入。选抒适当的121浓吃可大大增加核的，化活性，提高剪切效率。
6，170进行剪切反应试验，结果显25 60，时，剪切反应效率随温度增高而升高，显了典型的蛋白酶的催化活性特点，到701时，核酶和革巴以。分子结合开始不稳定。故切割产物降低改变底物浓度测定切割结果，应用如1 1以1作法可求出反应的1和。如值。
结果明，剪切效率随底物浓度增大而减少。这是因为随打底物的减少以与底物碰撞机会减少同，反应产物与底物竞争对反应也有定的抑制作用，常数阻和力要取决于反应条件应动力学双倒数作能够很好地定点切割底物2人分子，从测得效果。另外，由于我们使用的是自我剪切锤头状核酶，*大限度保证了核酶在胞内外活力的致性，为核酶用于临床治疗1引起的尖锐湿抚奠定了有力的实验基础，相信在不远的将来，用核酶进行基因治疗作为种抗病毒抗肿瘤的有效手段，可以为人类更好地的服务。
