第卷第期自然科学进展年月蚕豆萎蔫病毒中国分离物全序列及多聚蛋白切割位点签戚益军周雪平薛朝阳李德葆（浙江大学生物技术研究所，杭州摘要对蚕豆萎蔫病毒2（B琪分离物全序列进行了测定，全长由印个核普酸组成（不包括端包含一个长的开读框，该开读框起始于位，终止于位，编码一个分子量为的多聚蛋白。
对外壳蛋白亚基端氨基酸序列测定表明外壳蛋白大亚基和小亚基（是由多聚蛋白中谷酞胺与甘氨酸及谷酞胺与丙氨酸之间的切割产生的，砚含有叨个氨基酸，含有个氨基酸，与蚕豆病毒属（凡劝创艺。
病毒基因组核普酸及编码的蛋白质氨基酸序列比较表明，与分离物及广霍香轻花叶病毒具有很高的同源性，而与分离物的同源性较低。
与觅豆花叶病毒属（肠和线虫传多面体病毒属刀呼刃彩）的基因组结构相似，但序列同源性很低，与肛豆病毒属病毒的优和氨基酸具有共同的保守序列。
用株单克隆抗体进行一测定表明与B B从丙尸分离物（和）抗原上有差异。
关键词蚕豆婆蔫病毒多聚蛋白切割位点蚕豆萎蔫病毒（是蚕豆病毒属占诫二的典型种，其寄主范围广，能侵染多种双子叶及单子叶植物，该病毒在我国分布较广粒子球形，大小约so其基因组为两条单链正义分子，称一和病毒外壳蛋白由大小为和的两种亚基组成和将分离物划分为两个血清型（I和闭，而在国际病毒分类委员会第次报告中，已将两个血清型命名为两个不同的种，即和凡二俪与觅豆花叶病毒属洲坛二和线虫传多面体病毒属刀咖二同属于虹豆花叶病毒科（。
瓜勿对和的基因组结构及功能已有详细的研究，而对病毒基因组结构尚未进行很好的分析和比较。
本文报道了中国分离物的全基因组结构及其与虹豆花叶病毒科病毒的比较。
1望浏弄1 1一收修改稿，国家自然科学基金（批准号印浙江省青年人才专项资金和教育部跨世纪优秀人才培养计划基金资助项目，、联系人自然科学进展第卷材料与方法病毒来源研八分离物由周雪平等分离鉴定仁分离物教授（）提供，分离物由详博士（留记，提供。
所有病毒分离物均保存繁殖于昆诺黎叩d二叮d娇汰合成和克隆病毒粒子参照文献仁」提取。
用试剂从提纯病毒中提取。
以提纯为模板，参照山阴等的方法困进行反转录。
首先以为反转录引物获得端序列，根据此序列再设计合成引物护界对应于核昔酸序列的一进一步克隆得到端。
序列。。
连接于载体并转化大部分序列由两重叠的克隆测得。
末端序列用试剂盒（腼按说明书的方法克隆，用引物A人飞一对应于核昔酸序列的位和门工卫弘对应于核昔酸序列的一均根据以上所测定的序列设计合成。
核昔酸序列测定和序列分析用哪孙记试剂盒提取质粒，然后利用全自动测序仪或全自动测序仪进行序列测定。
测定时，每个片段均双向测定两个以上的不同克隆以确定正确的碱基序列。
序列分析软件为w二和功1决L甲协叩外壳蛋白端氨基酸序列测定将提纯病毒在等量降解缓冲液一嗅酚兰，甘油中煮沸变性，然后通过一电泳分离外壳蛋白大亚基和小亚基并转移至膜，然后利用氨基酸序列测定仪进行序列测定。
抗原表位型分析参照等图的三抗体夹心一法测定。
多克隆和单克隆抗体均由本实验室制备保存。
免疫印迹提纯病毒与等量降解缓冲液混合，煮沸后进行12聚丙烯酞胺凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维膜。
膜用牛血清蛋白封闭过夜，用抗的单克隆抗体反应hl后加人碱性磷酸酶标记的羊抗鼠醛底物显色后用灭菌水终止反应。
结果的核昔酸全序列序列测定结果表明，全序列由团个核昔酸组成（不包括端未知长度的多聚序列登录号R刊的碱基组成为和第期戚益军等蚕豆萎蔫病毒中国分离物全序列及多聚蛋白切割位点与和相似（差异在以内分析表明，编码一个很长的开读框（该起始于31位的终止于位的占总长的89编码一个由个氨基酸组成的分子量约为19 ku的蛋白。
在该中，在巧一位有第个如果由这个起始翻译，则翻译产物由氨基酸组成，分子量约为除在病毒正义链一位和病毒反义链（分别含编个氨基酸和个氨基酸的外，在病毒正反义链上没有更长的存在。
端非编码区含有个核昔酸，其中的比例很高而的比例很低（端非编码区含有两类重复序列，其中一类含有个核昔酸分别存在于23一另一类重复序列含有个核昔酸分别存在于一巧一位，还不完全重复于一位。
在的端中没有发现类似重复序列。
端含有核昔酸不包括几尾巴及端的碱基组成与类似，即富含而相对较编码的蛋白更豆花叶病毒科病毒基因表达方式为多聚蛋白切割，即基因组在功能上是单顺反子，其*初的表达产物由蛋白酶切割产生成熟的功能蛋白为了确定多聚蛋白的切割位点，将粒子降解产生的两种外壳蛋白亚基进行蛋白质端氨基酸序列测定。
大亚基末端测出的10个氨基酸序列为入小亚基末端测出的巧个氨基酸序列为这些序列分别与推导的多聚蛋白第肠一和一83位氨基酸序列完全一致。
由此确定了多聚蛋白切割加工的翻译策略，其切割位点为谷酞胺甘氨酸一和谷酞胺一丙氨酸一如多聚蛋白起始于**个则这些位点切割后产生一个分子量为名为巧的蛋白和两个蛋白亚基如果起始于第个则多聚蛋白切割后产生一个的蛋白（命名为码和两个外壳蛋白亚基图两个蛋白亚基推测的分子量分别为和与一测得的数值相符与的讨的比较凡中已有一些病毒的全序列被测出，这些病毒包括的两个分离物和及广霍香轻花叶病毒此外的两个分离物的部分序列也已在中登录。
核昔酸口一日丽工卜叹工今图助的基因组结构单线条表示非编码区，矩形框表示长编码的多聚蛋白氨基酸序列多聚蛋白可切割加工成个成熟蛋白推断的移动蛋白巧刃珑和每一蛋白包含的氨基酸数显示于对应的区域矩形框上方的数字代表中的位置多聚蛋白切割位点（甲令标示如图及编码的氨基酸序列与这些病毒分离物的同源性比较见表从表可看出与确丫2分离物的同源性远较场军分离物为与C翔讨扭，绍和脚讨的比较序列与和相比，核昔酸同源性分别为38一和一对多聚蛋白氨基酸序列比较发现确，与同源性比高。
自然科学进展第卷在区域，之间存在高度保守的氨基酸基序，表明玛可能具有与虹豆花叶病毒蛋白类似的转运功能，在病毒的胞间移动过程中起重要作用表与其它蚕豆病毒属病毒核昔酸及氨基酸之间的同源率燮哩病毒分离物核昔酸同源率氨基酸同源率护巧3基因库登录号一P司她M V加A卫幻1序列数据尚无报道35与安第斯马铃薯斑驳病毒莱豆豆荚斑驳病毒更豆花叶病毒仁和更豆重花叶病毒的外壳蛋白大小亚基氨基酸序列比较见图和图压二居二乙欣叹几洲乙曰乙0且几。1.几，心。盈，卫1`月卫扣和悦I日入I狱、叮蕊丁班翻g斗件O八，门勺。勺。月月二勺。月。
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几八A几A A口图与种外壳蛋白小亚基氨基酸序列比较黑体表示氨基酸在半数以上的病毒中一致可以看出这些病毒之间存在着高度保守的氨基酸基序，特别是在和的中间区域，与这些病毒之间的氨基酸一致性为一抗原表位型分析和免疫印迹利用种35的单克隆抗体汕测定与不同确叮分离物之间的反应。
结果表明，所有种犯，均能与35反应，但均不与分离物和反应。
不同的与35的反应强度有差异，和3反应*强，其次为而反应*差。
与从浅和反应的差异说明了两种病毒外壳蛋白之间抗原性存在差异。
利用单克隆抗体和3与变性的和外病毒粒子进行检`动测，结果表明和3只与35的外壳蛋白图分离物份和与大亚基反应，不与壳蛋白小亚基及单克隆抗体和的外壳蛋白大小亚基反应图这表明和的检测这些单抗作用的抗原表位型是连续的，并且是针对的，且和的忧的抗原表位型是有差异的。
讨论从叫首先于从澳大利亚的蚕豆上分离到。
虽然与在血清学上无关系，且场叩由蚜虫传播，而由甲虫传播，但由于B确T有类似的理化特性，因此在分类上曾属于二。
后与刀轻花叶病毒一自然科学进展第卷起成立了一个的分类组，称蚕豆病毒组临现在凡劝二和从卿，二一起归在更豆花叶病毒科中本文报道的全序列分析充分支持了这一分类系统。
与肠二和丛即之间存在着许多相似性，包括端为几卜表达方式为多聚蛋白切割，位于多聚蛋白端，且和之间存在保守的氨基酸基序。
和端均存在几，但目前尚不知是否含有飞。
由于端序列是利用试剂盒分别通过末端转移酶加和d（汀获得，因此保证了末端没有缺失核昔酸。
与相似，可能也存在两个翻译起始位点。
翻译可能起始于31位的产生蛋白，还可能起始于位的产生蛋白。
在和位均为翻译起始的亚理想耐位点，因为在的一位为但在位没有存在仁在中，已有证据表明多聚蛋白的**个和第个在离体和活体中均可起始翻译且第个是亚理想翻译起始位点，而第个是有效翻译的理想起始位点对于的研究表明，两个起始位点的翻译产物均有功能且初步证据表明，第个翻译起始是同时通过扫描遗漏和内部起始i币两种方式进行的在巧仁和沮耐病毒中已证明内部的翻译起始是通过内部核糖体结合产生的。
翻译起始于还是巧，或两个位点可以同时起始翻译，仍需进一步试验加以证明。
壳蛋白亚基的端氨基酸序列测定表明，是由谷酞胺一甘氨酸一和谷酞胺丙氨酸一切割产生的。
在和丛即中，的切割位点包括一和一邓一和一和一即一和一和顽和一珊因此一切割是常见的切割位点，而一则不常见。
但Q一切割已在邢一编码的多聚蛋白中发现洲。
根据在琼脂双扩散中是否形成刺角，和二将的个分离物分为两个不同的血清型，并命名为血清型和后称两个血清型称为和属血清型用针对种单克隆抗体进行抗原表位型比较表明与属血清型的和之间存在着差异，进一步证明了这种差异性。
血清型分离物和的部分序列已登录于中，对和氨基酸序列的比较表明，与和之间的一致性小于序列结果充分证明了将两类血清型称为不同的病毒是合理的。
致谢感谢意大利教授和英国博士提供分离物。
同时也感谢英国皇家学会院士和美国科学院士五教授及英国的教授修改初稿。
参考文献田讥二卯阳街且祀c曰心。
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恤司仆司田中1性延场，第期戚益军等蚕豆萎蔫病毒中国分离物全序列及多聚蛋白切割位点叼姻阅口。匕周雪平，李德葆。
蚕豆萎蔫病毒纯化及病毒蛋白质和基因组组分分析。
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